miRNA作为热门的小RNA分子，已经在科研圈火了很多年，尤其是lncRNA、circRNA的海绵机制被发现后，作为ceRNA的核心，又变得炙手可热。基于miRNA的功能缺失手段也较为成熟，但是不少实验者反馈：“做miRNA下调，QPCR检测miRNA，表达水平无变化”，这到底是怎么回事、以及如何解决呢？

现有miRNA抑制手段，无论是基于载体构建的、还是化学合成的，本质上都是用跟成熟体互补的反义miRNA（miRNA海绵体属于不完全互补的反义RNA重复），其可以通过结合miRNA，阻断其与靶基因结合，但并不能有效引发miRNA的降解，原因有两方面：其一是反义RNA与miRNA结合后，序列很短，导致Dicer酶（细胞内降解双链RNA的主角）不能有效结合；其二是miRNA与Ago2以RISC复合物的形式存在，该复合物也会导致Dicer酶无法高效结合。

首先，我们看下《RNA Biology》上一篇文章对于miRNA反义核酸的描述¹：

翻译一下：

因此，如果以反义RNA技术抑制miRNA功能，QPCR可以做，如果检测出表达水平下降还好，即便未检测到，也不表示抑制无效，正确的做法是直接检测目的基因蛋白水平是否有上调。但若实验者不清楚靶基因的情况下，不检测到miRNA下调，心里是没底的，如何解决呢？？？

反义核酸是在转录后水平发挥功能，要阻断miRNA的产生，理想情况是在生成成熟的miRNA之前阻断。此要求目前唯有CRISPR / Cas9能实现，Cas9通过在pre-miRNA序列中引入突变，从而破坏miRNA表达，是miRNA基因功能缺失研究的一种新方法。

CRISPR / Cas9能实现miRNA的敲除吗?技术会被认可吗？

首先，列举两篇运用吉凯基因Cas9病毒实现miRNA-KO的文章：

福建肖老师运用Cas9技术，针对miR-21基因设计sgRNA ，通过慢病毒递送细胞，并在RNA水平检测到mir-21的下调表达，从而研究出miR-21耗竭对CNE2鼻咽癌（NPC）细胞生物学特性及其潜在机制的影响²。

A. miR-21敲除靶点；B、C. 基因组设计引物扩增DNA并进行T7EN1酶检测编辑效率; D.QPCR检测成熟体表达水平

使用Cas9敲除miR-21之后，功能上也呈现出阳性：

（A-D）miR-21敲除削弱了CNE2细胞的生长，侵袭和迁移能力

此外，温医大第一医院的张老师使用Cas9敲除mir-545，研究了人环状RNA PRKCI（circPRKCI）通过抑制miR-545显示致癌性，促进人类神经胶质瘤细胞的病理进展³。

J. miR-545敲除后的表达水平（Cas9-C为对照）

所以，CRISPR / Cas9对于miRNA的KO是有效的、被认可的、且以QPCR检测表达量完全没有问题，那该技术内在的机制是怎样的呢？

首先，从miRNA形成机制谈起，前体pri-miRNA由基因组转录，该前体一般长约几KB至几十KB不等，每个miRNA的pri长度都不一样，pri在细胞核进行第一次剪切形成pre前体，pre一般长约70-120bp，含有类似于shRNA的颈环结构，pre随后转运至细胞质，在Dicer酶的剪切下变为成熟体。

miRNA成熟过程

针对pre前体序列设计Cas9靶点，将DNA打断后，依靠非同源末端连接（NHEJ)效应，在pre的成熟体或者颈环上引入突变碱基或者缺失，从而破坏颈环整体结构，引发pre剪切受阻，从而抑制了成熟体的产生。实验证明，靶点位于颈环或者臂都能有效抑制Dicer酶剪切⁴：

A.pre-mir21序列；B.针对pre不同位置设计Cas9靶点；C.错配酶+电泳检测靶点有效性；D.测序分析NHEJ后的pre序列；E.QPCR检测成熟体表达水平；F.验证miRNA下游靶基因的WB水平

综上所述，Cas9技术为piRNA、miRNA这类小RNA分子的抑制提供了除反义核酸之外的另一种选择，并能有效解决QPCR检测不稳定的难题。吉凯基因常规针对pre-miRNA设计两个Cas9靶点定制，80%的情况下能实现至少一个靶点对miRNA的有效KO，还在等什么，快来咨询吧！！！

【参考文献】

1. Anti-miRNA oligonucleotides: A comprehensive guide for design.

2. MicroRNA-21 depletion by CRISPR/Cas9 in CNE2 nasopharyngeal cells hinders proliferation and induces apoptosis by targeting the PI3K/AKT/MOTOR signaling pathway.

3. Circular RNA PRKCI promotes glioma cell progression by inhibiting microRNA-545.

4.Lentiviral CRISPR/Cas9 vector mediated miR-21 gene editing inhibits the epithelial to mesenchymal transition in ovarian cancer cells.